一、什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC) 是從原發(fā)性腫瘤脫落到血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)并在血液循環(huán)中攜帶到全身的細(xì)胞。CTC可以滲出并成為遠(yuǎn)處器官中額外腫瘤（轉(zhuǎn)移瘤）隨后生長的種子，這種機(jī)制是造成絕大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡的原因。CTC 的檢測(cè)和分析可以幫助早期患者預(yù)后并確定適當(dāng)?shù)亩ㄖ浦委煛?

二、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的發(fā)展歷史

1869年，Thomas Ashworth首次在一名患有轉(zhuǎn)移性癌癥的男性血液中觀察到了CTC，將循環(huán)細(xì)胞的形態(tài)與來自不同病變的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行徹底比較后，Ashworth 得出結(jié)論：“有一件事是肯定的，如果它們 （指CTC）來自現(xiàn)有的癌癥結(jié)構(gòu)，它們一定已經(jīng)通過了大部分的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)健全腿的內(nèi)隱靜脈”。

CTC在現(xiàn)代癌癥研究中的重要性始于 1990 年代中期，當(dāng)時(shí)證明 CTC 存在于疾病的早期階段。Paul Liberti 發(fā)明的采用鐵磁流體（膠體磁性納米粒子）和高梯度磁選機(jī)的精密靈敏磁分離技術(shù)使這些結(jié)果成為可能。從那時(shí)起，各種其他技術(shù)已應(yīng)用于 CTC 計(jì)數(shù)和鑒定。

現(xiàn)代癌癥研究表明，CTC 來源于原發(fā)腫瘤的克隆，證實(shí)了 Ashworth 的說法。為理解CTC 的生物學(xué)特性所做的重大努力已經(jīng)證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起著關(guān)鍵作用。此外，高度敏感的單細(xì)胞分析表明，在單細(xì)胞水平上，蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)定位存在高度異質(zhì)性，CTC 反映了原發(fā)性活檢和轉(zhuǎn)移部位的變化。

三、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的優(yōu)勢(shì)

CTC或液態(tài)活檢的檢測(cè)與傳統(tǒng)組織活檢相比具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。
1. 它們是非侵入性的，可以重復(fù)使用，并提供有關(guān)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、疾病進(jìn)展和治療效果的更多有用信息。例如，對(duì)癌癥患者血液樣本的分析發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的進(jìn)展，CTC 檢測(cè)有增加的傾向。
2. 進(jìn)行血液檢測(cè)既簡單又安全，并且隨著時(shí)間的推移可以采集多個(gè)樣本。相比之下，實(shí)體瘤的分析需要侵入性程序，這可能會(huì)限制患者的依從性。
3. 隨著時(shí)間的推移監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的能力可以促進(jìn)對(duì)患者治療的適當(dāng)修改，從而可能改善他們的預(yù)后和生活質(zhì)量。預(yù)測(cè)疾病未來進(jìn)展能力的重要方面是消除在重復(fù) CTC 計(jì)數(shù)低且不增加時(shí)進(jìn)行手術(shù)的需要；避免手術(shù)的明顯好處包括避免與癌癥手術(shù)的先天致瘤性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。

四、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的特征

CTC分為不同的類型：上皮型、間質(zhì)型和混合型。他們的惡性程度差別很大，手術(shù)治療可將原發(fā)腫瘤病灶鏟除，但之前釋放的CTC仍殘留在血管中，手術(shù)治療后通常會(huì)配合藥物治療，大部分殘留的CTC會(huì)受到藥物和免疫系統(tǒng)的攻擊而被殺死，但是有一部分CTC特別是間質(zhì)型CTC有很強(qiáng)的耐藥性，他們能躲避藥物和免疫系統(tǒng)攻擊存活下來。存活下來的CTC會(huì)隨著血液循環(huán)另尋新的轉(zhuǎn)移陣地，這也是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原因。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）通常具有非典型性的細(xì)胞形態(tài)，一般比血液細(xì)胞，正常組織細(xì)胞體積大；細(xì)胞核大，不規(guī)則，細(xì)胞核質(zhì)比高；不易發(fā)生變形。

在轉(zhuǎn)移性疾病患者中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的頻率約為每毫升全血 1-10 個(gè)CTC。相比之下，一毫升血液含有幾百萬個(gè)白細(xì)胞和十億個(gè)紅細(xì)胞。這種低頻率與識(shí)別癌細(xì)胞的困難相關(guān)，意味著理解 CTC 生物學(xué)特性的一個(gè)關(guān)鍵組成部分需要能夠從每毫升血液中分離出 1 個(gè) CTC 的技術(shù)和方法，或者通過富集，或者更好的是通過無富集分析來識(shí)別所有 CTC 亞型都具有足夠高的清晰度，以滿足各種癌癥類型患者的診斷病理圖像數(shù)量要求。迄今為止，已在多種上皮癌（乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌）中檢測(cè)到 CTC，臨床證據(jù)表明，具有轉(zhuǎn)移性病灶的患者更有可能分離出 CTC。

五、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的富集

一般來說，外周血中CTC的數(shù)量極少，1ml血液中約有4×109紅細(xì)胞、2×108血小板、6×106白細(xì)胞，而CTC只有1-10個(gè)，因此CTC的檢測(cè)面臨巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

常用的CTC富集方法包括非特異性富集法和特異性富集法。非特異性富集法主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)原理，包括：密度梯度離心法、過濾法、細(xì)胞電學(xué)特征法等，這種非特異性的方法往往具有一定的局限性，如：富集效率低、靈敏度和特異性較低、易受細(xì)胞形態(tài)影響等。特異性富集法多數(shù)是依據(jù)抗原抗體原理，包括：免疫磁珠富集法、芯片法、納米粒富集法等，其中免疫磁珠法又分為陰性富集（負(fù)選）和陽性富集（正選），常見的陰性富集法是利用耦連CD45抗體的磁珠吸附白細(xì)胞，在磁場(chǎng)作用下去除白細(xì)胞，富集CTC；陽性富集是通過偶聯(lián)EpCAM抗體的免疫磁珠捕獲EpCAM陽性的CTC，適用于EpCAM或CK陽性的CTC。

六、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的分析與鑒定

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對(duì)所得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以進(jìn)一步確定CTC細(xì)胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數(shù)目在動(dòng)態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標(biāo)志物也在變化，通過對(duì)CTC表面標(biāo)志物檢測(cè)，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。常用的CTC檢測(cè)技術(shù)如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測(cè)序等。

1. 免疫熒光法（IF）: 實(shí)體腫瘤細(xì)胞一般均為上皮來源，細(xì)胞內(nèi)會(huì)表達(dá)角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標(biāo)示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對(duì)來自實(shí)體瘤CTC中的瘤標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，從而達(dá)到檢測(cè)CTC的目的。這也是目前檢測(cè)CTC的最常見方法。缺點(diǎn)是在CTC形成過程的間質(zhì)化(EMT)階段，大量的CK會(huì)降解，從而在CTC檢測(cè)過程中出現(xiàn)假陰性，為此需要其他腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)示物 (如 EpCAM、HER2、CA19-9 等) 染色作為補(bǔ)充，以提高 CTC 檢出的陽性率。免疫熒光法是目前最常用的方法。

2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據(jù)已知細(xì)胞內(nèi)特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細(xì)胞內(nèi)的基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術(shù)與CTC結(jié)合，不僅可以檢測(cè)CTC表面標(biāo)志物，也可以檢測(cè)CTC細(xì)胞內(nèi)部的標(biāo)志物及核型等

3. 反轉(zhuǎn)錄PCR: 提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結(jié)合RT-PCR可同時(shí)對(duì)若干個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)可用于檢測(cè)CTC攜帶的驅(qū)動(dòng)基因的突變情況。

4. 二代測(cè)序 : CTC數(shù)量少，直接進(jìn)行二代測(cè)序難度大。需要將單細(xì)胞的DNA擴(kuò)增后，再利用二代測(cè)序檢查基因序列。但是，目前單細(xì)胞測(cè)序的技術(shù)僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，未來向市場(chǎng)推廣還有很長的路要走。而且由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞測(cè)序是否有代表性還需要更多的科學(xué)研究來證明。

七、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)的未來發(fā)展方向

CTC檢測(cè)是對(duì)抗癌癥的關(guān)鍵工具，在癌癥早期診斷、治療監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和用藥指導(dǎo)中起著關(guān)鍵性作用?！跋∮行浴笔荂TC檢測(cè)最大的難點(diǎn)，如何從幾億個(gè)血細(xì)胞中精準(zhǔn)捕獲幾個(gè)CTC細(xì)胞？富集效率極為重要。因此迫切需要開發(fā)一種更靈敏、更具特色、更簡便高效的檢測(cè)系統(tǒng)。CTCs 檢測(cè)的臨床實(shí)用性需要進(jìn)行進(jìn)一步的大規(guī)模的研究進(jìn)行驗(yàn)證，但其多功能性和優(yōu)勢(shì)為癌癥的診斷和預(yù)后提供了新的工具，相信在未來幾年循環(huán)腫瘤細(xì)胞將大大促進(jìn)精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

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